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スター活性

至適でない条件下において、制限酵素の基質特異性が変化したり特異性がゆるんだりすることがある。この変化した特異性における反応性をスター活性(star activity)と呼ぶ。「スター」の由来は文献12

スター活性を誘起する条件

高いグリセロール濃度

5%(v/v)以上のグリセロール濃度によってスター活性が誘起されることがある。 制限酵素の保存溶液は、凍結、変性、凝集を防ぐためにかなり高濃度(50%)のグリセロール溶液である。そのため、反応液量は制限酵素原液の10倍以上であることが望ましい。

高濃度の制限酵素

切断するDNA量に対し、制限酵素の量が極端に多い場合にスター活性が誘起されることがある。 (制限酵素の種類によるが、100 units/ug以上)

低いイオン強度

(制限酵素に付属するバッファーの場合は問題ない。) 25mM以下のイオン強度の場合、スター活性が誘起されることがあるので、自作バッファーを使用する場合に注意する。

高いpH

(制限酵素に付属するバッファーの場合は問題ない。) pHが8.0以上の場合、スター活性が誘起される制限酵素がある。反応液のpHが極端に異なる場合は一度エタ沈。(70% EtOH aq.)

有機溶媒の存在

DMSOエタノールエチレングリコールジメチルアセタミドジメチルフォルムアミド(DMF)などの有機溶媒存在下、スター活性が誘起されることがある。

Mgイオンでない金属イオン

(制限酵素に付属するバッファーの場合は問題ない。) TypeIIの制限酵素は切断反応の補因子としてMgイオンが必要だが、Mgイオン以外の金属イオン(Mn2+, Cu2+, Co2+, Zn2+)が配位した場合にスター活性が誘起されることがある。

スター活性を防ぐには

制限酵素付属のバッファーを使う場合

  1. できるだけ少ない量(数ユニット)の制限酵素で消化する。酵素溶液量が多いと過度の消化やグリセロール濃度の上昇につながる。酵素溶液量の10倍を目安に(酵素溶液が1μLの場合、反応液量は10μL)
  2. 有機溶媒が混入しないように。たとえばエタ沈後のエタノールに注意。

自作バッファーを使う場合

  1. できるだけ少ない量(数ユニット)の制限酵素で消化する。酵素溶液量が多いと過度の消化やグリセロール濃度の上昇につながる。
  2. 有機溶媒が混入しないように。たとえばエタ沈後のエタノールに注意。
  3. イオン強度を上げる(高い塩濃度で阻害されない制限酵素ならば)
  4. pHを7.0に近づける。
  5. 補因子にはMg2+を使う。

References

  1. Relaxation of recognition sequence of specific endonuclease HindIII.
    Nasri M, Thomas D
    Nucleic Acids Res14p811-21(1986 Jan 24)
  2. Sequence-specific endonuclease BamHI: relaxation of sequence recognition.
    George J, Chirikjian JG
    Proc Natl Acad Sci U S A79p2432-6(1982 Apr)
  3. Relaxed specificity of endonuclease BamH1 as determined by identification or recognition sites in SV 40 and pBR 322 DNAs.
    Kolesnikov VA, Zinoviev VV, Yashina LN, Karginov VA, Baclanov MM, Malygin EG
    FEBS Lett132p101-4(1981 Sep 14)
  4. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease.
    Polisky B, Greene P, Garfin DE, McCarthy BJ, Goodman HM, Boyer HW
    Proc Natl Acad Sci U S A72p3310-4(1975 Sep)
  5. DNA site recognition and reduced specificity of the Eco RI endonuclease.
    Woodbury CP Jr, Hagenbüchle O, von Hippel PH
    J Biol Chem255p11534-48(1980 Dec 10)
  6. Alteration of the specificity of PvuII restriction endonuclease.
    Nasri M, Thomas D
    Nucleic Acids Res15p7677-87(1987 Oct 12)
  7. Self-generated DNA termini relax the specificity of SgrAI restriction endonuclease.
    Bitinaite J, Schildkraut I
    Proc Natl Acad Sci U S A99p1164-9(2002 Feb 5)
  8. Cloning and sequencing of restriction fragments generated by Eco RI*.
    Gardner RC, Howarth AJ, Messing J, Shepherd RJ
    DNA1p109-15(1982)

リンク