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プラスミド抽出

大腸菌などの菌体を溶解し、プラスミドDNAを抽出する方法で、精製度は高くないが操作が簡便な抽出方法である。プラスミドや菌株にもよるが、培養液数1-2mLで数百ナノグラムスケールのプラスミドDNAが得られる。

  1. プレートからコロニーを拾って、液体培地で一晩培養
  2. 培養液をチューブに移して遠心して回収。(1min at 4°C 15,000rpm)
  3. 0.2mLのSolIを加え、ボルテックスで分散。
  4. 0.4mLのSolIIを加え、軽く浸透して氷上でインキュベート。
    (5minくらいたっても透明~半透明の溶液にならない場合は菌体量が多すぎる)
  5. 0.3mLのSolIIIで中和する。ここでDNAは溶解したままアルカリ性で溶けていた分子(タンパク質など)が凝集する。
  6. 遠心で不溶物を沈殿させる。(15min at 4°C 150,000rpm)
  7. 上清を新しいチューブに移してRNaseAを2 μL添加して37°C 20minインキュベート。

溶液調製

SolI

組成目的
1M Tris-HClバッファー(pH8.0)5 mL
0.5M EDTA4 mLDNase活性の抑制

H2Oで200mLにメスアップ。

グルコースは特に必要ない。細胞壁のペプチドグリカンを分解するためにリゾチームを添加したり、RNAを分解するためにRNaseを添加することもある。(酵素を加えない場合、単に菌体を洗って分散するためのバッファーと考えてよいでしょう)

SolII

組成目的
NaOH1.6g脂質の可溶化、タンパク質の変性・可溶化、RNAの塩基触媒的加水分解
SDS2g脂質の可溶化、タンパク質の変性・可溶化

H2Oで200mLにメスアップ。プラスチックボトルに保存。

SolIII

組成目的
酢酸カリウム58.9gSolIのアルカリを中和
酢酸24mLSolIのアルカリを中和
H2O106mL