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ホスファターゼ

ホスファターゼは5'末端のリン酸を脱リン酸化する。ホスファターゼ処理後は5'はヒドロキシル末端となる。

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BAPとCIAP

遺伝子工学用の試薬としては、CIAP (Calf Intestine Alkaline Phosphatase)や、BAP(Bovine alkaline phosphatase)がよく用いられる。

BAP

  1. DNAを17μLのddH2Oに溶解
  2. 10xバッファー 2μL添加
  3. BAP 1μL添加
  4. 60-65℃, 1 hr インキュベート

CIAP

  1. DNAを17μLのddH2Oに溶解
  2. 10xバッファー 2μL添加
  3. CIAP 1μL添加
  4. 37℃, 30min インキュベート
    (あるいは、37℃, 15min → 50℃, 15min)

メモ

  • ライゲーション時にクローニングベクターの自己環状化を抑制することができる。
  • 基質としてADPを用い、キナーゼを用いても脱リン酸化は可能。
  • ホスファターゼの不活性化は難しく、実際の実験ではホスファターゼ処理後、フェノール・クロロホルム抽出が推奨されている。
  • 5'末端に放射性ラベル処理する前にホスファターゼを用いることもある。