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末端の平滑化

核酸の突出末端は酵素によって平滑末端にすることができる。酵素によって平滑化後の配列が変わることがあるので注意。

突出末端を平滑化するには、次のような酵素活性を利用する。

  • ポリメラーゼ活性(5'→3'合成活性)による相補塩基の埋め込み(fill-in)
  • エキソヌクレアーゼ活性(末端からの分解活性)による削り込み(trim)
  • エンドヌクレアーゼ活性(分解活性)による切断

合成活性と分解活性によって、生成される末端の配列が異なってくるので、断片のライゲーション時には注意が必要である。

DNA polymeraseによる平滑化

市販されている平滑化キットの多くは、T4 DNAポリメラーゼを利用しており、5'→3' 合成活性によるFill-inと3'→5' エキソヌクレアーゼ活性が同時に進行する。ポリメラーゼによるFill-inのためのdNTPが必要。(キットなら、バッファーは同梱されている。)



5'→3'活性(▼部分)でfill-inされる。
3'→5'エキソヌクレアーゼ活性(X部分)で削りこまれる。

S1 Nucleaseによる平滑化



S1 NucleaseはDNAやRNAの一本鎖部分を特異的に切断するエンドヌクレアーゼである。一本鎖である突出末端や、ループ部分を切断することができる。

反応条件

NaOAc (pH4.6) 30mM
NaCl 280mM
ZnSO4 1mM

ベンダー情報

Vendor平滑化キット内の酵素Web上の情報
TaKaRa BioT4 DNAポリメラーゼGoogleで検索
ニッポンジーンT4 DNAポリメラーゼGoogleで検索
TOYOBOKOD PolymeraseGoogleで検索

(2006.3.10 現在)

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