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末端の平滑化 [2013/06/09 18:08] (現在)
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 +======末端の平滑化======
 +核酸の突出末端は酵素によって平滑末端にすることができる。酵素によって平滑化後の配列が変わることがあるので注意。
 +
 +突出末端を平滑化するには、次のような酵素活性を利用する。
 +  *ポリメラーゼ活性(5'​->​3'​合成活性)による相補塩基の埋め込み(fill-in)
 +  *エキソヌクレアーゼ活性(末端からの分解活性)による削り込み(trim)
 +  *エンドヌクレアーゼ活性(分解活性)による切断
 +合成活性と分解活性によって、生成される末端の配列が異なってくるので、断片のライゲーション時には注意が必要である。
 +
 +
 +=====DNA polymeraseによる平滑化=====
 +市販されている平滑化キットの多くは、[[T4 DNAポリメラーゼ]]を利用しており、5'​->​3'​ 合成活性によるFill-inと3'​->​5'​ エキソヌクレアーゼ活性が同時に進行する。ポリメラーゼによるFill-inのためのdNTPが必要。(キットなら、バッファーは同梱されている。)
 +
 +{{bio:​t4polymerase_product.png|}}
 +
 +\\ \\ 
 +5'​->​3'​活性(▼部分)でfill-inされる。\\ ​
 +3'​->​5'​エキソヌクレアーゼ活性(X部分)で削りこまれる。
 +
 +=====S1 Nucleaseによる平滑化=====
 +
 +{{bio:​s1nuclease_product.png|}}
 +
 +\\ \\ 
 +S1 NucleaseはDNAやRNAの一本鎖部分を特異的に切断するエンドヌクレアーゼである。一本鎖である突出末端や、ループ部分を切断することができる。
 +
 +
 +====反応条件====
 +
 +^[[酢酸ナトリウム|NaOAc]] (pH4.6) |  30mM|
 +^[[塩化ナトリウム|NaCl]] ​                  ​| ​ 280mM|
 +^[[硫酸亜鉛|ZnSO4]] ​                 |  1mM|
 +
 +/*
 +
 +Images were created by [[http://​wiki.symplus.co.jp/​doku.php/​cmaster/​%E6%9C%AB%E7%AB%AF%E3%81%AE%E5%B9%B3%E6%BB%91%E5%8C%96|ConstructMaster]].
 +
 +
 +*/
 +
 +======ベンダー情報======
 +^Vendor^平滑化キット内の酵素^Web上の情報^
 +|TaKaRa Bio|[[T4 DNAポリメラーゼ]]|[[http://​www.google.co.jp/​search?​hl=ja&​q=Takara+DNA+Blunting+Kit&​lr=|Googleで検索]]|
 +|ニッポンジーン|[[T4 DNAポリメラーゼ]]|[[http://​www.google.co.jp/​search?​hl=ja&​q=nippongene+Blunting+Convenience+Kit&​lr=|Googleで検索]]|
 +|TOYOBO|KOD Polymerase|[[http://​www.google.co.jp/​search?​hl=ja&​q=bio.toyobo+Blunting+high+%E3%83%A9%E3%82%A4%E3%82%B2%E3%83%BC%E3%82%B7%E3%83%A7%E3%83%B3&​lr=|Googleで検索]]|
 +(2006.3.10 現在)
 +
 +======書籍======
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 +  *{{amazon>​jp:​4879621498}}
 +  *{{amazon>​jp:​489706659X}}
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 +{{tag>​3'​突出 5'​突出 平滑 実験プロトコル}}